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神經(jīng)環(huán)路功能解決方案

1、光遺傳系統(tǒng)實現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路調(diào)控

神經(jīng)信號調(diào)控傳統(tǒng)采用藥物或電刺激方式，前沿的神經(jīng)調(diào)控方式為光遺傳神經(jīng)調(diào)控。光遺傳學(xué)結(jié)合遺傳學(xué)手段選擇性在某類細胞上表達光敏感通道，通過活體組織內(nèi)光傳送技術(shù)，改變這些細胞的活動及功能。該技術(shù)利用分子生物學(xué)、病毒生物學(xué)等手段，將外源光敏感蛋白基因?qū)牖罴毎校诩毎そY(jié)構(gòu)上表達此光敏蛋白；然后通過特定波長光的照射，光敏蛋白即可激活與關(guān)閉，從而控制細胞膜上離子通道的開與關(guān)，改變細胞膜電壓的變化進而引起神經(jīng)元的激活或抑制。

因此光遺傳學(xué)為精確定位與剖析不同類型神經(jīng)元在神經(jīng)環(huán)路及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神疾病中的作用提供了有力的研究手段。光遺傳刺激系統(tǒng)通過多通道控制器來控制 LED光源，利用光來激活或者抑制特定神經(jīng)元的活性，可視化地調(diào)控和記錄細胞亞群的反應(yīng)，然后讓細胞將這種反應(yīng)進行重現(xiàn)，從而明確這一類細胞對行為的功能性作用。運用此技術(shù)廣泛用于研究該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能，特別適用于在體、甚至清醒動物行為學(xué)實驗。

光纖記錄系統(tǒng)

光纖記錄系統(tǒng)的目的是實時檢測細胞的活性變化?；阝}離子濃度變化的熒光成像技術(shù)被廣泛用來記錄神經(jīng)元活性。以 GFP 為例，鈣離子濃度敏感蛋白 GCaMP 通過熒光信號強度變化可以很好地表征神經(jīng)元的活性，其中 GCaMP6 具有很高的時間靈敏度和熒光信號信噪比。將 GCaMP 表達到神經(jīng)元中，然后通過光纖激發(fā) GCaMP 的熒光并實時監(jiān)測記錄熒光信號強度的方法即光纖記錄。 Plexon Photometry 在體光纖記錄系統(tǒng)的激發(fā)光目前主要是470nm (GFP)。

在體多通道電生理記錄系統(tǒng)

多通道記錄系統(tǒng)主要是通過多通道電極陣列植入到實驗動物頭部，將神經(jīng)元的胞外高頻的動作電位信號以及記錄電極所在腦區(qū)的局部場電位信號實時采集出來，通過多級腦電信號放大，把幾微伏的腦電信號放大到幾伏，然后經(jīng)過數(shù)模轉(zhuǎn)換，把信號傳輸?shù)接嬎銠C中，通過軟件分析所有信號，實現(xiàn)實時分析，為腦中群體神經(jīng)元編碼、存儲和提取神經(jīng)信息提供了時間上的同步，也反映了大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)信息處理的不同活動模式。所有放大后的腦電信號也可以被記錄下來，然后通過系統(tǒng)中傳感器得到動物體的準(zhǔn)確空間位置，并且相關(guān)信息與腦電信息被同步后存入計算機。

光遺傳、光纖記錄、在體電生理記錄等神經(jīng)功能調(diào)控與記錄技術(shù)可以結(jié)合使用，采集活體大小鼠在清醒或者其他狀態(tài)下的神經(jīng)功能信息。以下以“光遺傳在體電生理記錄小鼠紋狀體D1中型多棘神經(jīng)元的活動模式”為例。

光遺傳-在體多通道電生理記錄系統(tǒng),用其對直接通路中型多棘神經(jīng)元(D1-MSN)的活動模式進行在體記錄。方法:首先向D1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體背外側(cè)注射攜帶光敏陽離子通道channelrhodopsin-2(ChR2)基因的腺相關(guān)病毒,使ChR2在D1-MSN上通過Cre重組酶的同源重組而特異性表達。之后通過光刺激和電生理記錄相結(jié)合的方式在體記錄D1-MSN的活動模式。結(jié)果:D1-Cre小鼠紋狀體在注射病毒后通過熒光顯微鏡觀察,可發(fā)現(xiàn)明顯的熒光信號,證明病毒正常表達。通過光遺傳-在體多通道光電極記錄系統(tǒng),本研究成功地在紋狀體內(nèi)用光刺激誘發(fā)了MSN的電活動。通過對記錄的電信號進行數(shù)據(jù)分析,證明了光刺激誘發(fā)的電信號確實來自于D1-MSN,成功地對D1-MSN活動模式進行了在體記錄。結(jié)果提示光遺傳-在體多通道光電極記錄系統(tǒng)是一種對紋狀體D1-MSN電活動模式記錄的可選新方法。

神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)解決方案

光透明介觀成像神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)成像：通過神經(jīng)熒光標(biāo)記+光透明+光片介觀成像多項前沿技術(shù)的聯(lián)用可以獲得神經(jīng)環(huán)路的投射和神經(jīng)胞體定位、分布等神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)信息。

嗜神經(jīng)相關(guān)病毒標(biāo)記與轉(zhuǎn)基因熒光神經(jīng)標(biāo)記

嗜神經(jīng)相關(guān)病毒是一類能感染神經(jīng)細胞，且能沿神經(jīng)環(huán)路傳播增殖的病毒。利用嗜神經(jīng)相關(guān)病毒作為示蹤工具，可以實現(xiàn)神經(jīng)回路跨突觸示蹤及神經(jīng)元投射示蹤。嗜神經(jīng)相關(guān)病毒具有高特異、靈敏和靈活地標(biāo)記和有效地研究神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)改造的嗜神經(jīng)相關(guān)病毒包括腺相關(guān)病毒AAV、偽狂犬病毒PRV、狂犬病毒以及其它可感染神經(jīng)元的慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等。

轉(zhuǎn)基因熒光標(biāo)記技術(shù)通過轉(zhuǎn)基因方法可對特異性或非特異性神經(jīng)元進行熒光標(biāo)記。轉(zhuǎn)基因熒光適用于包括果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠、靈長類等在內(nèi)的各種模式動物，可以研究在正常、疾病及發(fā)育過程的各種狀態(tài)下的神經(jīng)環(huán)路、神經(jīng)投射、神經(jīng)胞體等方面內(nèi)容。

光透明技術(shù)

光透明技術(shù)是一種讓生物組織具有光學(xué)透明性的新型技術(shù)。而正常的生物組織中成分復(fù)雜，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和血紅素等物質(zhì)對光的傳播造成阻礙。光透明技術(shù)就是使用一種試劑或幾種試劑組成的混合液通過浸泡、電泳或灌注等處理方式,使大塊組織或完整器官達到視覺下透明或光學(xué)儀器下可見的效果。

LSI VTC離體光透明法

通過結(jié)合多種熒光標(biāo)記手段及光片照明成像，LSI VTC方法可以實現(xiàn)小鼠全腦及胚胎的三維神經(jīng)結(jié)構(gòu)信息的獲取。同時，LSI VTC方法對脂溶性膜染料Dil良好的兼容性，使得其能夠?qū)崿F(xiàn)正常小鼠腦、脊髓、脾等多種組織器官的三維血管網(wǎng)的重構(gòu)，以及糖尿病小鼠腎小球病理結(jié)構(gòu)的三維可視化和定量統(tǒng)計分析。LSI VTC所具備的快速透明能力、對包括脂溶性染料在內(nèi)的多種熒光色團的兼容性及良好的形態(tài)保持等優(yōu)勢，有望為多種組織器官的形態(tài)學(xué)與病理學(xué)研究提供重要的工具。

LSI VFC離體光透明法

LSI VFC方法結(jié)合光片照明成像可以實現(xiàn)小鼠全腦、肌肉、腎臟等多種完整器官的神經(jīng)與血管成像。由于其優(yōu)秀的透明及熒光保持能力，LSI VFC方法在大體積生物組織透明成像上具有顯著的優(yōu)勢，并且在透明生物組織的長期重復(fù)成像和弱熒光信號成像上具有極大的應(yīng)用價值。

激光片層掃描成像技術(shù)

光片顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的不同在于激發(fā)光的照明方式。它的照明光是一張與成像面平行的薄薄的“光片”，只有焦平面的樣品被照亮，而其上下的樣品不受影響。

激光片層掃描成像技術(shù)優(yōu)勢：

提高了圖像和背景的反差(Signal-to-Background Ratio) 和軸向分辨率：光片照明技術(shù)保證了焦平面上下的樣品不會被激發(fā)，具備和共聚焦顯微鏡類似的光學(xué)切片功能；

減少了光漂白和光毒性：與傳統(tǒng)的熒光照明技術(shù)相比，光毒性可以被降低20-100倍，這樣就能在更接近生理狀態(tài)的條件下，對活體生物樣品進行長時間的三維成像；與激光共聚焦和雙光子顯微鏡使用低QE的PMT的點掃描成像相比，光片顯微鏡使用高QE的CCD或sCMOS相機進行面成像，大大提高了成像速度和圖像的信噪比。共聚焦需要幾分鐘甚至幾小時才能拍完的樣品，用光片顯微鏡只需要幾秒到幾分鐘。因此，光片顯微鏡也特別適合用于大樣品成像。

神經(jīng)結(jié)構(gòu)三維成像方案：

全腦神經(jīng)示蹤三維成像

全腦神經(jīng)胞體三維成像

神經(jīng)環(huán)路的功能與結(jié)構(gòu)研究的意義

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和機能單位。大腦由上百億個神經(jīng)元組成，堪稱人類最復(fù)雜的器官。以大腦皮質(zhì)為例，大腦皮質(zhì)（即大腦表層）主要由兩類神經(jīng)細胞構(gòu)成，一類是興奮性神經(jīng)細胞，一類是抑制性神經(jīng)細胞。大腦內(nèi)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)主要是γ-氨基丁酸。興奮性和抑制性的動態(tài)平衡（E/I balance）是大腦正常功能和可塑性形成和維持的重要基礎(chǔ)，如果這個平衡被打破則會誘發(fā)癲癇、帕金森、抑郁癥等多種神經(jīng)疾病。因此，興奮性突觸和抑制性突觸的相互調(diào)控過程至關(guān)重要。

通過光遺傳、光纖記錄、在體電生理記錄等神經(jīng)功能調(diào)控與記錄技術(shù)可以結(jié)合使用，采集活體大小鼠在清醒或者其他狀態(tài)下的神經(jīng)環(huán)路功能信息。通過神經(jīng)熒光標(biāo)記+光透明+光片介觀成像+全腦大數(shù)據(jù)處理分析技術(shù)聯(lián)用，通過神經(jīng)熒光標(biāo)記+光透明+光片介觀成像多項前沿技術(shù)的聯(lián)用可以獲得神經(jīng)環(huán)路的投射和神經(jīng)胞體定位、分布等神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)信息。